考点1 基因工程
1．基因工程的3种基本工具
(1)性核酸内切酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。
(2)DNA连接酶：①E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端；②T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。
(3)载体：①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有一个至多个酶切割位点；③具有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。
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提醒 (1)酶≠DNA酶≠解旋酶
酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
(2)使用酶的注意点：a.一般用同种酶切割载体和目的基因；b.不同的酶也能切割出相同的黏性末端。 (3)DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。 2．基因工程的操作流程
(1)目的基因的获取：①从基因文库中获取。②利用PCR技术扩增。③化学方法人工合成。 提醒 ①PCR技术扩增 a．原理：DNA双链复制。
b．条件：模板DNA、引物、游离的脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶。
↓
复性：55～60 ℃，引物与单链DNA结合
c．过程 ↓
延伸：70～75 ℃，在热稳定DNA聚合酶Taq酶 作用下合成子链
不需要模板。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建 ①基因表达载体的组成
变性：90～95 ℃，DNA解链
②化学方法人工合成：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，
②构建过程
提醒 ①基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。 ②启动子、终止子
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a．启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 b．终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 ③目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 (3)将目的基因导入受体细胞
根据受体种类确定基因工程的受体细胞及导入方法。
①植物：植物体细胞或受精卵——导入方法常用农杆菌转化法、花粉管通道法、基因法(本法针对单子叶植物)。
②动物：受精卵——导入方法为显微注射法。 ③微生物：细菌——导入方法为感受态法。 (4)目的基因的检测与鉴定的方法
①检测目的基因是否导入受体细胞：DNA分子杂交技术。 ②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。 ④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。 3．蛋白质工程
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1．(2018·全国Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__________________ ________________________________________________________________________ ______________________________________________________________(答出两点即可)。 (2)体外重组的质粒可通过Ca参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
解析 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
方法技巧 (1)基因工程常用工具有3种——酶、DNA连接酶、载体；(2)常用载体有3种——质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒；(3)获取目的基因有3种方法——基因文库、PCR扩增、人工合成；(4)常用3类受体细胞及导入方法：植物细胞——农杆菌转化法；动物细胞——显微注射法；微生物细胞——Ca处理转化法。
2．(2017·全国Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用
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________________作为载体，其原因是_____________________________________。 (3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 (1)细菌是原核生物，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，将完整的基因A导入大肠杆菌后，无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是细菌病毒，专门寄生在细菌体内；家蚕是动物。因此用家蚕作为表达基因A的受体，不选用噬菌体作为载体。
(3)原核生物常作为基因工程中的受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌。
(4)检测目的基因A是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。
(5)艾弗里实验表明加热杀死的S型细菌的DNA可转入R型菌中，这充分显示“DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体”，因此，可为基因工程理论的建立提供启示。 方法技巧 (1)基因组文库中目的基因因有内含子部分，所以在真、原核细胞之间只能部分基因可以交流，但cDNA文库中基因无内含子部分，可以在不同物种之间交流。(2)病毒做载体时，运载目的基因进入受体细胞时具有特异性。(3)要提取细胞内的物质如mRNA、色素、H2O2酶等要做的是破碎细胞这一步，常用的方法为研磨，为研磨充分常加SiO2。
3．(2017·全国Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题： (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_________________________________________________。 提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。 (2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________ ________________________________________________________________________。
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(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是______________________________________________________________ ______________________________________________________________(答出两点即可)。 (4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)嫩叶中基因表达强烈，相应的mRNA多(或嫩叶组织细胞易破碎) 防止提取的mRNA被RNA酶降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则合成cDNA (3)质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因，便于筛选；质粒中含有复制原点等 (4)磷酸二酯键 (5)几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译
解析 (1)由于嫩叶中几丁质酶转录的mRNA较多，因此在进行基因工程操作时，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，原理是mRNA可根据碱基互补配对原则逆转录为cDNA。 (3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中有标记基因，便于筛选；质粒中含有复制原点等。
(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。
4．(2018·湖北七市教科研协作体高三联考) 基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题： (1)构建基因组文库的一般步骤：
①提取某种生物体内的__________________，用适当的酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；
②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；
③重组载体导入到________的群体中储存，基因组文库构建完成。
(2)与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是_____________________ ______________________________________________。
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(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种酶处理。其目的是___________________ _____________________________________________________。
(4)将重组DNA导入受体菌之前，常用________处理，提高导入的成功率。 答案 (1)①全部DNA或全部基因 ③受体菌
(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因 (3)以获得与DNA片段相同的黏性末端 (4)Ca 解析 (1)构建基因组文库的一般步骤为：
①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；
②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；
③重组载体导入到受体菌的群体中储存，基因组文库构建完成。
(2)cDNA文库只能收集到生物发育到某时期已发生转录的基因，而基因组文库能收集到全部基因，因此与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。
(3)载体与DNA片段结合前，需要使用同种酶处理，以获得与DNA片段相同的黏性末端。 (4)将重组DNA导入受体菌群之前，常用钙离子(Ca)处理，以提高导入的成功率。 5．(2018·菏泽高三模拟)乙肝病毒是一种DNA病毒。中国的乙肝病毒携带者约占总人口的10%。我国科学家通过基因工程生产出乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。回答下列问题：
(1)乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是________________________________________ ________________________。
(2)乙肝病毒的基因组可编码的蛋白质及功能如下：Core蛋白是外壳蛋白；Pre—core与抑制宿主的免疫反应有关；X蛋白与病毒复制有关；S蛋白是病毒的包膜蛋白，与病毒进入细胞有关。通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的________________________________________________________________________。 (3)通过基因工程生产乙肝疫苗的过程如图所示： ①②③乙肝病毒――→有关基因――→细菌――→大量生产疫苗 分离导入发酵
a．若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有________________________________________________________________________种，其作用是____________________________________________________________________。 b．在①②过程中需使用的工具酶是________________。②过程中常用的载体是________________。
c．为提高②过程的转化效率，常采用的方法是______________________________。 (4)使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好，从细胞结构的角度分析，原因是
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____________________。
答案 (1)肝细胞表面有乙肝病毒的受体 (2)Core蛋白和S蛋白 (3)a.2 使DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸 b．酶和DNA连接酶 质粒 c．用Ca(CaCl2)溶液处理细菌 (4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理
解析 据题图分析可知，①表示从乙肝病毒中分离有关抗原基因；②过程包括基因表达载体的构建以及导入细菌；③可用特定抗体筛选含目的基因的细菌，并作为微生物发酵的工程菌。 (1)由于肝细胞表面有乙肝病毒的受体，所以乙肝病毒专一侵染肝细胞。
(2)根据题意分析可知，乙肝病毒作为抗原的部分应该是其外壳蛋白和包膜蛋白，即通过基因工程生产的乙肝疫苗的有效成分是上述病毒蛋白中的Core蛋白和S蛋白。
(3)a.PCR技术中，需要2种不同的引物，使DNA聚合酶能够从引物的结合端开始连接脱氧核苷酸。
b．在构建基因表达载体的过程中，需要使用的工具酶是酶和DNA连接酶，常用的载体是质粒。
c．为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用Ca(CaCl2)溶液处理细菌，使之成为感受态细胞。
(4)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理，因此使用酵母菌作为受体菌生产乙肝疫苗的效果更好。
6．(2018·咸阳二模)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的实线箭头表示相关酶的酶切位点，虚线箭头表示转录的方向。请分析回答下列问题：
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(1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用______________技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是______________、酶、原料、模板，该技术必须用__________________酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有__________________。
(2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ酶切割，原因是____________________________。图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用____________________酶对外源DNA、质粒进行切割。
(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，可用放射性同位素标记的____________作探针进
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行分子杂交检测，还需要在个体水平上鉴定，后者具体过程是______________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)PCR(或多聚酶链式反应) 引物 热稳定DNA聚合(或Taq) 标记基因 (2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因 BamHⅠ和HindⅢ (3)抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察烟草植株的生长状态 解析 (1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用PCR(或多聚酶链式反应)技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是引物、酶、原料、模板，该技术必须用热稳定DNA聚合酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有标记基因。
(2)从图中信息可知，SmaⅠ酶的切割位点位于目的基因和M抗生素抗性基因上。分析抗盐基因的DNA片段，可知该DNA含四种酶切点，其中SmaⅠ位于目的基因上，不宜采用。EcoRⅠ位于目的基因两侧，若用EcoRⅠ切割则目的基因会自身环化。BamH Ⅰ与HindⅢ位于目的基因两端，且质粒中也有相应的适合的切割位点，因此用BamH Ⅰ和HindⅢ才能完整地切下该抗盐基因，同时防止自身环化，保证目的基因与质粒连接方式的唯一性。
(3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的抗盐基因(或目的基因)作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态。
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