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第２４卷第３斑 西南农业大学学报 ＶｏＩ ２４．ＮＯ ３ ２０Ｏ２年６月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ａｍ４ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓ Ｊｕｎ．２００２ 文章编号：Ｉｔ３００—２６４２ ｃ２００２）０３一Ｏ２６８—０３ 猪笼草的组织培养 丰锋，李洪波，谢建英 （湛江海洋大学农学院，广东湛江５２４０８８） 摘要：以猪茏草（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍ／ｒａｂ／／￣）腋芽为试材，研究猪笼草的组培快繁，结果表明，外殖体的建立以１／２ ＭＳ＋６一ＢＡ． ＋Ｎ ＿岱培养基波体培养春季（３—６月）进行最佳。愈伤组织（或不定芽）增殖以ＭＳ＋６一ＢＡ１＋Ａｄ ＋ＮＡＡ０Ｉ＋１００ ｍｌ／Ｌ椰子汁最佳，高浓度（２ＯＯ ｍｌ／Ｌ）的椰子汁不利于愈鹤组织（或不定芽）增殖：继代芽的增殖以ＭＳ＋６一ＢＡ１ ＋ ＡｄＩ＿５＋Ｎ １＋１００—２ＯＯｍｌ／Ｌ椰子汁最好；生根培养用１／２ＭＳ＋６一 】＋ＮＡＡ１ ０，２０ ｄ后可长出２～４蒂根。 关键词：猪茏草；组织培养；繁殖 中围分类号：Ｏ ９４９ ７４９．３ 文献标识码：Ａ ＴＥＳＳＵＥ ＣＵｍＩＲＥ ＡＮＤ ＲＡＰＩＤ ＰＲ０ＰＡＧＡＴ【０Ｎ ０Ｆ＾ＴＥＰＥⅣ刀 ＥＳ ｎ ８『， ＦＥＮＧＦｅｎｇ。ＬＩＩｂＩＩｇ—ｂｏ。ＸＩＥ Ｊｉａｎ—ｙｉＩＩｇ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａ＠ａｎｇ，Ｇｕａａｇｄｏｎｇ ５２４０８８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂ醴ｒ９ｃｔ：ＡｘⅢ且ｒｙ ｂＩ ０ｆ 如ｗｅｒｅ ｕｓｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｏｄｔｕｒｅｉｎ Ｔ】ｇ ａｎｄ ａｌｌｔｌｌｎｌｎ ０ｆ１９９７～１９９９ｔｏｉｍ＇ｅｓ６ｇａｔｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃ卅 ｄｉｔｉｏｍｆ０ｒｔｈｅ ｒａｐｉｄｐｒｏｐａｇａｉｔｏｎ ０ｆｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ０ｎ１／２ＭＳ ＨｑＩ１ｉｄｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅ￣ｅｄ ｍ６一ＢＡ１ ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ＮＡＡ０ ０５ｍｇ／Ｌｉｎ Ｍａｒｃｈ ｌｏＭａｙ ｇａｖｅｔｈｅ ｂｅｓｔｍｓｕｈｓｆｏｒｔｈｅ ｐｍｄ 【ｍ ０ｆ ｖｉｒｕｓ—ｆｒｅｅｍａｔｅｒｋｄｓ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍｍｏ￣ｕｍｆｏｒ ｐｒｏｌｆｉｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｌ（０ｒ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ） 一 Ｐｅ ｔｏ ｂｅＭＳ＋６一Ｂ～ ＋Ａｄｔ０ｍｓ／Ｌ＋Ｈ Ｉｍｓ／Ｌ＋ｃｏｃｏｎｕｔｍｉｌｋ１００ｍｉ／ＬＩ ａｎｄ￣ｇｈｃｒ ｅｏｎｅｅｍｒａｆｉｏｎ ０ｆｃｏｃｏｎｕｔｍｉｌｋ（２ＯＯ ｎｉｌ／ Ｌ】ｓｈｏｖｅｄ ａｎｉｎｈｉｂｉｉｔｖｅ，￣ｆｅｃｔ．Ｂｅｓｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ０ｆｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｕｄｓＷＩｌｌＳｄｘａｉ￣ｅｄ叽ｔｈｅｍｏｄＪｔｍｌＭＳ＋６一ＢＡｔ ５ｍｅ／Ｌ＋ＡｄＩ ５ｍｅ／Ｌ＋ Ｎ ２ ｍｅ／Ｌ＋ｃｏｃｏｎｕｔｍｉｌｋ１００—２Ｏ０ｍｌ／Ｌ Ｃｕｌｔｕ￣ｄ ＯｎＩ／２ＭＳ＋６一ＰＡｏＩｍ ＋ＮＡＡ１ ０ｍｅ／Ｌ，ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｈｏｏｔ￣ｒｏｏｔｅｄ，ｅ￣ｌｉｌｙ ２０ ｄａｙｓ ｌ ｗｌ ：Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍ 船；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｍｐａｇａｔｍｎ 猪笼草（Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌ￣），别名食虫草、猪仔 甘凉，可清热止咳、利尿，主治急慢性肝炎，叶片可制 笼、招财进宝等，属猪笼草科猪笼草属植物。野生资 作凉茶，能避暑消热。由于种子发芽率极低，主采用 源位于我国云南、广东、海南等亚热带地区，多见与向 扦插繁殖，很难满足市场需求，我们采用组织培养方 阳温暖、湿润的山腰、谷地，且多与铁芒萁共生。为攀 法，成功繁殖出大量种苗，现报道如下 缘状亚灌木或草本，高ｌ～３ ｍ，其叶外形优美，形状 奇特，叶片长圆形或披针形，长ｌ０～２５ ｅｒａ，宽４ ８ １材料和方法 一，卷须柔弱，约与叶片等长，具囊状体或否（观赏价 值所在），囊状体长ｌ２～１６ ｏｎ２，宽２～４∞，有２纵棱， 试验材料为猪笼草腋芽，试验在湛江海洋大学园 囊盖阔卵形或椭圆状卵形，长２．５～３．５ ｃｍ，内面有许 林组培室进行。外殖体的建立采用：１．ＭＳ＋６一ＢＡ 多圆形的腺体。似一个个小小猪笼悬立空中，观赏价 （６一苄氨基嘌呤）＋ ＡＡ０ ０５（￣ｓ／Ｌ．单位下例）（Ⅱ一奈乙 值极高，可制作成盆景或盆栽供观赏，也可药用，性味 酸）；２．１／２ＭＳ＋６一ＢＡ１＋ＮＡＡｏ ｏ５；３．ＭＳ＋６一ＢＡ３＋ 鉴鍪最曹 翟 ＿市 妥助项 作者简介：丰锋（１９６９一），男，贵州纳雍人．湛江海洋太学讲师，从事植物组培快繁和化控研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com
第２４卷第３期 丰 锋等 猪蓖草的组织培养 ２６９ Ｎ．４Ａｏ．∞；ｌ～３号培养基同时设固体、液体培养，从 １９９７年至１９９９年分春（３～６月）、秋（９ ｌ１月）两季 进行，诱导出芽后，一部分芽转入愈伤组织培养基：４． ＭＳ＋６—８Ａｏ∞＋２，４一Ｄｏ＋ｊ；其余的芽转入芽增殖培 养基；５．ＭＳ＋６—８Ａ２＋ＮＡＡｏ．∞；当愈伤组织和芽增殖 到一定数量后分别转入培养基按 （３４）正交表设计 的试验组合６—１４号培养基，其中，Ａ因子为６一ＢＡ， 设６—８Ａｏ ５，６一ＢＡｔ ０，６一ＢＡｌ ５ ３个水平；Ｂ因子为 Ａｄ（腺素腺嘌呤），设ＡｄＩ，Ａｄ ，Ａ ｄ】０ ３个水平；ｃ因子 为ＮＡＡ，设Ｎ从０，，Ｍ ５，ＮＡ ０ ３个水平；Ｄ因子 为椰子汁（新鲜成熟椰子的胚乳），设５０ ｍｌ／Ｌ，１（３０ ｒｎｌ／ Ｌ，２００ ｍｌ／Ｌ ３个水平。以上培养基液体培养不加琼 脂，固体培养加琼脂４．５ ｇ／Ｌ，ｐＨ值均为５．８，蔗糖３Ｏ ｇ／Ｌ，培养温度２５～２８ ，光照强度２ ０００ Ｌｘ，每日光 照１０ ｈ，每处理接种３ｏ瓶，每瓶接种４块组织，２次重 复，接种物培养４０ ｄ后，统计每一接种物增殖芽数， 计算芽增殖倍数，对愈伤组织称重后统计重量增加的 倍数，再把２ ｃｒｎ以上芽苗转人生根培养基：１５．１／２ ＭＳ＋６—８Ａｏ １＋ＮＡＡＩ ｏ；１６．１／２ ＭＳ＋ＮｚＬ％５＋ 珂Ａｏ ５，２０ ｄ后观察生根情况 ２结果分析 ２．１外殖体的建立 从野外取回猪笼草茎段，流水冲洗干净，用利刀 去除叶片，注意保护腋芽，切成６～８ ｃｍ长带２个芽 的芽段，用试管刷流水刷净污泥，无菌室内用７５％酒 精消毒６０ ｓ，再用Ｏ．１２％一０．１５％升汞消毒１５ ｍｉｎ， 无菌水冲洗４～５次，消毒后的材料分别接种到１ ３ 号固体、液体培养基中，１４ ｄ后１号培养基脓芽开始 萌动，１８ ｄ后２号培养基腋芽开始萌动，２１ ｄ后３号 培养基腋芽开始萌动，２号培养基上茎段多萌发２个 芽，１，３号培养基上茎段多萌发１个芽，４０ ｄ后统计 腋芽萌发情况见表１，由表１可看出，①春季萌芽率 普遍比秋季高；②液体培养萌芽率比固体培养高；③２ 号培养基组织１／２ＭＳ＋６一ＢＡｔ＋Ｎ ∞更有利于猪 笼草脓芽的萌发。说明对芽的诱导以１／２ ＭＳ＋６一 ＢＡ１＋ＮＡＡ￣培养基液体培养春季最佳。．ｃ６ 裹ｌ猪差蕈外殖体蔚芽情况．／１９９７年至１９９９年３卓平均 萌芽牢／％ 培养基 春季臼～６月） 秋季（９～ｌ１月） 编号 固体培养 液体培养 固体培养 箍悻培养 ２．２快速繁殖 ２．２．１愈伤组织的增殖把诱导出的芽一部分转接 到４号培养基，３０ ｄ后有愈伤组织或同肘有不定芽产 生，一般先出现少量愈伤组织团，然后产生大量丛生 芽，把产生的愈伤组织和丛生芽一起转接人按ｋ（３ ） 正交表设计的试验组合６～１４号培养基，进行６一 ＢＡ，Ａｄ，ＮＡＡ，椰子汁对愈伤组织（或不定芽）生长影 响试验，４０ ｄ后统计愈伤组织（或不定芽）重量增加的 倍数，并进行方差分析见表２，结果表明各因子间差 异均极显著。对各因子间分别进行多重比较，表明：６ 一ＢＡ ３个水平问、ＮＡＡ ３个水平间、椰子汁３个水平 间差异均极显著；Ａｄ１０与Ａｄｌ，Ａｄ３间差异极显著，ＡｄＩ 与Ａｄ５间无显著差异。综合以上因素，并对各处理组 合间进行多重比较表明：①处理６即ＭＳ＋６一ＢＡｌ＋ Ａｄｔ０＋Ｎ ，＋椰子汁１（３０ ｍｌ／Ｌ愈伤组织（或不定 芽）增重倍数最高；②相对较高浓度的６一ＢＡ（１～１．５ ｍｌ／Ｌ）有利于愈伤组织（或不定芽）的生长；③高浓度 的椰子汁（２ＯＯ ｎ￣ｌ／Ｌ）抑制愈伤组织（或不定芽）的生 长，应≤１（３０ ｍｌ／Ｌ为好。 衰２赶伤组荨！（或不定芽）增殖倍数方差分析 ２．２．２芽的增殖把诱导出的芽余下部分转接到５ 号培养基进行芽的增殖，一般４０ ｄ左右可继代１次， 增殖率在１．５—２．５之间，当芽生长到一定数量后，转 入按ｋ（３４）正交表设计的试验组合６一ｌ４号培养基， 进行６一ＢＡ，Ａｄ，ＮＡＡ，椰子汁对芽增殖影响试验，４０ ｄ后统计芽增殖的倍数，并进行方差分析见表３，结果 表明各因子问差异均极显著。对各因子问分别进行 多重比较，表明：６一ＢＡｌ ５与６一ＢＡ０ ５，６一ＢＡ【０问差 异极显著，６一ＢＡｏ．５与６一ＢＡｔ ０间无显著差异；Ａｄｌ与 Ａｄｓ，Ａｄｌ０问差异极显著，Ａｄｓ与Ａｄ【ｏ间无显著差异； Ｎ丸Ａｏ．１与Ｎ从０∞，ＮＡＡ１ ０问差异极显著，ＮＡ ５与 ＮＡＡ１ ０间无显著差异；椰子汁３个水平间差异极显 著。综台以上因素，并对各处理组台间进行多重比较 表明：①较高浓度的６一ＢＡ（１～１．５ ｍｇ／Ｌ）有利于猪 笼草芽的增殖；②低浓度的６一ＲＡ（Ｏ ５ ｍｇ／Ｌ）＋高浓 度的ＮＡＡ（Ｏ．５～ｌ ｎｗ＇Ｌ）或较高浓度的６一ＢＡ（１ Ｏ ￣ｇ／Ｌ）＋高浓度的ＮＡＡ（１．０ｍｇ／Ｌ）均不利于芽的增 殖；③高浓度的６一ＢＡ（１．５ ｍＣＬ）＋较高浓度的Ａｄ（５ 维普资讯 http://www.cqvip.com
２７０ 西南农业大学学报 ２００２年６月 一１０ｍｇ／Ｌ）＋较高浓度的椰子汁（１００—２００ 几）组 合有较高的增殖率（３．８６）。 寰３芽增殖信鼓方差分析 注：表２．３中 。Ｌｃ ２．Ｂ】：８．６５ ＊＊表示差异极显著。 ２、３生根培养 把２ ｅｍ以上芽苗转人生根培养基１５，１６中，２０ ｄ 后观察生根情况，小芽生根均较迅速，以１５号培养基 生根最好，２０ ｄ后有２—４条根，根长１—３ ｃｍ，说明一 定浓度的细胞素与生长素配比有利于生根。 ３讨论和结论 谭文澄（１９９１）认为，大多数植物应在其生长开始 的季节采样较好，生长末期采样，外殖体在培养基中 反应迟钝或不能培养成功。猪笼草生长于亚热带地 区，一年凹季均可生长，但仍以春季生长最旺盛。同 时，其生长环境多为向阳温暖、湿润的山腰、谷地，尤 有流水的湿地生长最佳，植株高大、茎粗、叶大、囊 状体大，根据其野生环境条件采用液体培养更能诱导 其腋芽萌发。因此外殖体的建立以春季取材在１／２ ＭＳ＋６一ＢＡｌ＋Ｎ．ａａ￣ｏ．∞上液体培养为好；愈伤组织（或 不定芽）的增殖阶段ＭＳ＋６一ＢＡｌ＋Ａｄｌ０＋ＮＡＡｏ．１＋ １００ ｍｌ／Ｌ椰子汁最佳，高浓度（２ｍ ｍｌ／Ｌ）的椰子汁不 利于愈伤组织（或不定芽）的增殖，李浚明（１９９２）、谭 文澄（１９９１）认为在组织培养过程中加入一些植物器 官的汁液，常常产生良好的效应，如椰子汁、番茄汁 等，这些汁液中含有若干促进细胞的因子以及大 量的游离氨基酸，提供了一些生理活性物质，补充了 一些末知的微量成分，从而促进了愈伤组织（或不定 芽）的生长；李浚明（１９９２）认为愈伤组织的长期继代 培养，会引起细胞内染色体变化，如出现多倍体、非整 倍体、染色体丢失、断裂、重组等现象，这种继代培养 中染色体的不稳定性，对保持供体植物的遗传性是不 利的，但对育种来说，这种变异却大有利用价值，有可 能从中筛选出优良变异的细胞系，为新品种选育提供 物质基础。因此对猪笼草的快速繁殖，在牧有明确愈 伤组织途径的遗传稳定性之前，不能在生产上推广应 用，由于猪笼草的观赏价值主要在囊状体，囊状体通 常为绿色，若能利用愈伤组织途径加上辐射诱变选育 出红色或其他颜色囊状体，将会大大提高其观赏价 值。芽的增殖以碰；＋６一ＢＡｌ ５＋Ａｄ１ ｊＮＡＡｏ．＿－０ ５为 好，少用或不用椰子汁以降低繁殖成本。 参考文献： ［１］丰锋，谢建英，新开发的观叶植物——猪笼草【ｊ］．西 南农业大学学报，２０００．２２（２）：１１１． ［２］谭文澄，戴策刚．观赏植物组织培养技术［Ｍ］．北京：中国 林业出版社．１９９１． ［３］李搜明．植物组织培养教程［Ｍ］．北京：中国农业大学出 版社．１９９２． ［４］曹孜义，刘国民．实用植物组织培养技术教程［Ｍ］．兰州， 甘肃科学技术出版社，１９９９． 【５］黄学林．高等植物组织离体培养的形态建成及其 ［Ｍ］．广州：科学出版社，１９９５