凝血酶冻干粉检验规范+2011.9.9

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技术文件 凝血酶冻干粉检验规范 文件编号 页 次 版本/修改状态 第 2 页，共 7 页 1 检验标准

1.1 外观

白色或类白色的粉末。 1.2 无菌

依法检查，应符合规定。 1.3 理化性能 1.3.1水分

含水分不得超过5.0%。 1.3.2 效价

按无水物计算，每1mg凝血酶的活力不得少于90单位。每瓶凝血酶活力应为标示量的80%以上。 1.3.3 蛋白质浓度

凝血酶中蛋白质浓度应占45%-70%。 1.3.4 比活性

每毫克蛋白质中凝血酶的活力应为90-250单位。 1.3.5 pH值

pH值应为6.5-7.5。 1.4 包装与标志

包装与标志应符合GB/T 15346-94有关规定，包装应附有标签，并注明下列内容：

1）产品名称、包装规格、生产批号、试剂含量、储存条件、有效期、厂名厂址及联系方式； 2）进厂时包装应洁净完好，无破损。

2 抽样要求与方法

2.1 抽样要求：以相同来源、相同规格的一次收货量，且生产工艺条件和生产时间基本相同的单位产品为同一检查批的样品。 2.2抽样方法：在同一检查批中随机抽取五瓶检验。

3 检验方法

3.1 外观

在自然光线下，目测检验，应符合1.1的要求。 3.2 无菌

取本品，分别加入0.9%无菌氯化钠溶液5ml溶解后，依《微生物限度检查法标准操作规程》检查，应符合1.2的要求。 3.3 理化性能 3.3.1 水分

精密称取供试品适量，除另有规定外，溶剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定，应符合1.3.1的要求。

3.3.2 效价

参照附录1的方法检测，应符合1.3.2的要求。 3.3.3 蛋白质浓度

参照附录2的方法检测，应符合1.3.3的要求

3.3.4 比活性

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技术文件 凝血酶冻干粉检验规范 文件编号 页 次 版本/修改状态 第 3 页，共 7 页 根据公式:酶比活性= 酶效价/蛋白质浓度,计算凝血酶的比活性，应符合1.3.4的要求。 3.3.5 pH值

称取供试品适量，配制成1%的供试品溶液检测，应符合1.3.5的要求。 3.4 包装与标志

在自然光线下，目测检测，应符合1.4的要求。

4 检验规则与接收准则

4.1检验规则，见表1 检验类型 检验项目 1.1外观 常规检验 1.2无菌 1.3 理化性能 1.4包装与标识 检验水平（SL） 接收质量限（AQL） S-4 S-4 S-4 S-4 1.0 0.1 0.1 1.0 备注

注：型式检验项目为本规范全部检验项目，有下列情况之一时应型式检验：

1） 更换厂家时；

2） 厂家材料、配方、主要工艺有较大改变时； 3） 停止供货6个月后，重新恢复供货时； 4） 连续供货12个月时。 4.2接收准则

正常供货时,除1.5 “包装与标志”项外其它所有的项目全部检验合格时,该批产品合格，可接受使用，如有一项或多项不合格时,该批产品不合格，不可接受使用。

注：标识与包装不合格时，不作为整批来料不合格判定的依据，可作让步接收使用，但需记录并向供应商反馈。如有因包装问题造成产品破损及污染的，应将该部分挑选后作退货处理，实际收料数量应将该部分扣除。

5 留样

每批凝血酶冻干粉留样应不少于三次检测用量，并注明厂家、批号、来样日期、留样量等，按说明书中规定的温度保存。

6 相关文件

6.1 中华人民共和国药典2010版 6.2 GB/T 15346-94 化学试剂 包装及标志

6.3 GB/T 2828.1-2003 计数抽样检验程序 第1部分 按接收质量限(AQL)检索的逐批检验抽样计划 6.4 QT-01/051(1)《微生物限度检查法标准操作规程》

7 质量记录

7.1 《凝血酶冻干粉检验记录表》 7.2 《原材料检验报告》

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技术文件 凝血酶冻干粉检验规范 文件编号 页 次 版本/修改状态 第 4 页，共 7 页 附录1 凝血酶冻干粉效价检测方法

一 纤维蛋白原溶液制备

精密称取纤维蛋白原约30mg，用0.9％氯化钠溶液1.5ml溶解，加凝血酶0.1ml(约3单位)，快速摇匀， 室温放置约1小时至完全凝固，取出凝固物，用水洗至洗出液加银试液不产生浑浊，在105℃干燥3小时,称取重量，计算纤维蛋白原中含凝固物的含量(％)。按此含量另取适量纤维蛋白原，用0.9％氯化钠溶液制成含0.2％凝固物的纤维蛋白原溶液，用0.05mol/L磷酸氢二钠溶液或0.05mol/L磷酸二氢钠溶液调节pH值至7.0～7.4，再用0.9％氯化钠溶液稀释成含0.1％凝固物的溶液（纤维蛋白原溶液的浓度，指所含的可凝结蛋白的百分浓度）。

二 标准品溶液的制备

取凝血酶标准品，加0.9%氯化钠溶液溶解并分别定量稀释制成每1ml中含5.0单位、6.4单位、8.0单位与10.0单位的标准品溶液。 三 供试品溶液的制备

取本品5瓶，精密称定（精确到小数点后三位）每瓶供试品的重量，分别加入适量0.9%氯化钠溶液溶解，转移至5个量瓶中，用上述溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取适量，用上述氯化钠溶液定量稀释制成每1ml中约含7单位的供试品溶液。 四 测定

取内径1cm、长10cm的试管4支，各精密加入纤维蛋白原溶液0.9ml，置37℃±0.5℃水浴中保温5分钟，再分别精密量取上述4种浓度的标准品溶液各0.1ml，迅速加入各试管中，立即计时、摇匀，置37℃±0.5℃水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间。每种浓度测5次，求平均值（5次测定之最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，否则重测）。标准品溶液的浓度应控制凝结时间在14～60秒为宜。在双对数坐标纸上，以标准品效价（单位）的对数为横坐标，凝结时间（秒）的对数为纵坐标，进行直线回归。

精密量取供试品溶液0.1ml，按上述方法平行测定5次，求出凝结时间的平均值（误差要求同标准曲线），用直线回归方程求得单位数，按下式计算： 凝血酶效价（单位／毫克）＝(Ｕ×10×Ｖ)∕Ｗ 凝血酶效价（单位／瓶）＝Ｕ×10×Ｖ

式中：Ｕ为0.1ml供试品在标准曲线上读得的实际效价(单位)； Ｖ为每瓶供试品溶解后的体积，ml； 10为0.1ml换算成1.0ml的数值； Ｗ为每瓶供试品的重量，mg。

并计算出每瓶相当于标示量的百分数。

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技术文件 凝血酶冻干粉检验规范 文件编号 页 次 版本/修改状态 第 5 页，共 7 页 附录2 蛋白质含量检测方法

一、实验原理

考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在

488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

二 器材与试剂

1 器材

分光光度计、漩涡混合器、试管、移液管或移液 2 试剂

2.1 考马斯亮蓝储存液：95%无水乙醇： 100ml 88%磷酸： 200 ml 考马斯亮蓝： 350mg

室温下可长期保存，稳定。

2.2 考马斯亮蓝工作液：蒸馏水： 425ml

95%无水乙醇：15 ml

88%磷酸： 30 ml G250储存液： 30 ml

可根据体积相应缩小比例配制，用1号滤纸过滤并保存于室温棕色瓶中，可使用数周。 2.3牛血清白蛋白标准品

将牛血清白蛋白配制成1.0mg/ml，取牛血清白蛋白1.00g，用0.9%NaCl溶液溶解，转入1000ml容量瓶中，定容。300ul分装，保存于-20度，备用。

三 标准曲线制作

1 将1.0mg/ml牛血清蛋白溶液稀释10倍，制成0.10mg/ml的蛋白浓度。

2 取6支试管，分别编号，1支作空白，其余试管按下表中剂量分别加入0.10mg/ml的标准蛋白质溶液、0.9%NaCl溶液和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。

3 加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管。

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技术文件 凝血酶冻干粉检验规范 文件编号 页 次 版本/修改状态 第 6 页，共 7 页 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

4 用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线，求回归方程(0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50)。

管号 标准蛋白质浓度(mg/ml) 标准蛋白质体积(ml) 0.9%NaCl溶液(ml) 考马斯亮蓝试剂(ml) 对应的吸光度A595 1 0.0 0.0 0.1 5.0 2 0.02 0.02 0.08 5.0 3 0.04 0.04 0.06 5.0 4 0.06 0.06 0.04 50 5 0.08 0.08 0.02 5.0 6 0.10 0.10 0.00 5.0 四 样品中蛋白质含量的测定

1 若是原液或成品, 每个样品需做2个或3个稀释度：

2 若待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至1mg/ml，再稀释10倍；待测样品如为未知浓度的样品，可以根据bradford标准品颜色目测后稀释样品。

3 待测样品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。

4 样品中蛋白质的含量应处理在所测范围内，依照标准曲线制作的方法检测，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量(一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算)。

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DOCUMENT REVISION RECORD

文件更改记录表

文件编号： 文件名称：凝血酶冻干粉检验规范 No. 1 2 FCO：20050801

生效日期 版本/ 修改状态 首版 更改描述 拟制/修改 QC/ 审核 QC经理/ 批准 管理者代表/ 孙邦福 QR－4.2.3－03/B