ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108384857 A(43)申请公布日 2018.08.10

(21)申请号 201810419708.9(22)申请日 2018.05.04

(71)申请人 良培基因生物科技（武汉）有限公司

地址 430000 湖北省武汉市东湖高新区高

新大道666号光谷生物城C6栋北楼5楼C6501、C6504(72)发明人 王昕昀　

(74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限

公司 31253

代理人 冯子玲(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书2页 说明书6页序列表1页 附图2页

CN 108384857 A(54)发明名称

ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法(57)摘要

本发明公开了一种ddPCR技术检测

试剂盒及检测方法，IDH1R132H基因变异的引物、

检测方法包括提取外周血cfDNA、针对IDH1R132H突变型和野生型设计2个探针和1对引物、以cfDNA为模板进行ddPCR扩增、对获得的扩增产物进行数据分析，获得IDH1R132H突变基因绝对量和比例。基于此方法，本发明还提供了一种检测IDH1R132H基因变异的试剂盒。本发明提供的引物扩增片段为83bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明提供的检测探针，可从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1R132H基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可对人IDH1R132H基因变异进行绝对定量检测，对指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。本方法无需采集组织标本，仅使用外周血即可完成检测，特别适合对组织取样不耐受的患者。

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1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述IDH1 R132H突变基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记，野生基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记。

3.一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；2)对所述的检测样本进行cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132H变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；

4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1 R132H变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。

4.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中cfDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。

5.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM。

6.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中IDH1 R132H突变基因检测探针含量为200-400nM，野生基因检测探针含量为200-400nM。

7.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的的方法，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟，93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

8.根据权利要求7所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的方法，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。

9.一种用于绝对定量检测人IDH1 R132H基因变异的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针。

10.根据权利要求9所述的一种用绝对定量检测人IDH1 R132H基因变异的的试剂盒，其

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特征在于，所述试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。

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ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测

方法

技术领域

[0001]本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法。背景技术

[0002]脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的35％～60％，成人发病率达8～10/10万，5年生存率为20％～30％，近年来其发病率仍有上升的趋势。世界卫生组织(WHO)已确立将脑胶质瘤分类成多种亚型并且将其从I定级到IV(指示其恶性程度)的许多组织学的临床准则。[0003]异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。哺乳动物细胞中的IDH有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，其转录mRNA长2339bp，含有10个外显子，编码由414个氨基酸残基组成的异柠檬酸脱氢酶1，主要定位于细胞浆和过氧化物酶体。IDH1作用于一个称为柠檬酸周期的能量生成途径。细胞中的IDH1突变是原发性人体脑瘤主要亚型的共同特点。目前发现的IDH1基因突变都集中在第4外显子的12和13密码子R>H(≥90％)称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别脑胶质瘤患者风险级别的指标之一。

[0004]目前脑胶质瘤的诊断方法包括影像学检查、细胞病理学、组织病理学诊断、直接测序法和荧光定量PCR法。影像学检查包括淋巴造影、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高；通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异形性、血管增生、坏死等进行分级，不但不方便，而且会对患者造成人体伤害，甚至可能造成穿刺道肿瘤转移；而直接测序法检测突变存在步骤繁琐、成本高、灵敏性差的；荧光定量PCR虽然具有重复性好，特异性强等优点，但由于其依赖于Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。

[0005]循环肿瘤细胞是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便、无创、可重复检测。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周

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血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极低，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、ARMS-PCR)，仍难以准确、可靠地检测出肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织、高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中肿瘤相关基因突变的方法。

发明内容

[0006]为了克服现有技术的上述不足，本发明提出一种ddPCR技术检测IDH1R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法，本发明设计的引物和探针特异性强，并且以数字PCR为检测平台，判断待测样品中是否含有IDH1 R132H基因变异和发生突变的绝对含量及比例。该方法对于检测全血样本中IDH1 R132H基因变异灵敏度高，能够在患者血循环中检测出循环肿瘤DNA，克服了侵入性取样检测存在风险的技术问题。[0007]为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：[0008]本发明首先提供了一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示。

[0009]进一步地，所述IDH1 R132H突变基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记，野生基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记。

[0010]本发明还提供了一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的的方法，包含以下步骤：

[0011]1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；[0012]2)对所述的检测样本进cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物；[0013]3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132H变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；[0014]4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1 R132H变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。[0015]进一步地，ddPCR反应体系中cfDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。[0016]进一步地，ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM。

[0017]进一步地，ddPCR反应体系中IDH1 R132H突变基因检测探针含量为200-400nM，野生基因检测探针含量为200-400nM。

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进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

[0019]更进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。[0020]最后，本发明提供了一种用于绝对定量检测人IDH1 R132H基因变异的的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针。[0021]进一步地，所述试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。

[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果在于：[0023](1)本发明提供的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物扩增片段为83bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明提供的检测探针，可以从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1 R132H基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1 R132H基因变异进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。[0024](2)本方法不需要采集组织标本，仅使用外周血即可完成检测，减少了病人的痛苦，特别适合对组织取样不耐受的患者；[0025](3)本发明提供的用于绝对定量检测人IDH1 R132H基因变异的的试剂盒可以结合ddPCR技术简单、方便地对样本所携带IDH1 R132H基因变异DNA的绝对数量和比例进行检测，操作简单，且具有特异性好、灵敏度高的特点。附图说明

[0026]图1为实施例2中野生型IDH1 R132H的DNA样本的荧光检测二维结果图；

[0027]图2为实施例2中突变体与野生型含量比为1/100的样本的荧光检测二维结果图；[0028]图3为实施例2中突变体与野生型含量比为1/1000的样本的荧光检测二维结果图；[0029]图4为实施例2中突变体与野生型含量比为1/10000的样本的荧光检测二维结果。具体实施方式

[0030]展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库，所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。

[0031]ddPCR的原理是通过无限稀释形成油包水的微滴，从而将PCR反应分配至20000个纳米级别的微滴中进行。PCR反应结束后，通过微滴分析仪检测每个微滴的荧光信号，含有荧光信号的微滴判为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算得出靶分子的起始拷贝数。与传统的定量PCR相比，ddPCR不需要建立标准曲线就能实现靶分子的绝对定量检测，而且具有特异性强、灵敏度高(最低可检测单拷贝的靶分子)、定量准确等优点。[0032]一方面，本发明提供了一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对

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和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示。其中IDH1 R132H突变基因检测探针序列和野生基因检测探针序列的5’端均设有一种荧光标记，3’端均设有另一种荧光标记。[0033]另一方面，本发明还提供了一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的的方法，包含以下步骤：

[0034]1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；[0035]2)对所述的检测样本进cfDNA抽取处理，从而获得cfDNA抽取物，参考QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒说明书抽提cfDNA；[0036]3)以步骤2)所得到的cfDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132H变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132H突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，优选为500nM，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM，优选为500nM；ddPCR反应体系中IDH1 R132H突变基因检测探针含量为200-400nM，优选为250nM，野生基因检测探针含量为200-400nM，优选为250nM。

[0037]ddPCR反应体系中gDNA模板的含量为0.3-2ng/L，优选为1ng/μL。[0038]ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。ddPCR反应条件优选为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。[0039]4)对所述PCR扩增产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有突变基因模板，用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，从而得出样本中IDH1 R132H变异的绝对含量以及相对与总cfDNA的比例。[0040]另一方面，本发明提供了一种用于绝对定量检测人IDH1 R132H基因变异的的试剂盒，其包括上述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物对和探针。在一些实施例中，该试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。试剂盒可以结合ddPCR技术简单、方便地对样本所携带IDH1 R132H基因变异DNA的绝对数量和比例进行检测，操作简单，且具有特异性好、灵敏度高的特点。

[0041]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。[0042]实施例1：

[0043]本实施例针对人IDH1 R132H基因目标区域的上下游设计了适用于ddPCR技术平台上定量检测R132H基因变异的引物；采用Taqman探针法进行设计，针对IDH1 R132H突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针。[0044]扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上、下游引物：[0045]上游引物SEQ NO1：5’-ccaacatgacttacttgatcccc-3’

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下游引物SEQ NO2：5’-aatatcccccggcttgtgag-3‘

[0047]IDH1 R132H突变基因检测探针，从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB猝灭基团，这种探针在退火时与基因突变型位点结合；[0048]SEQ NO3：5’-FAM-taagcatgatgacctatgat-MGB-3’[0049]野生型检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB猝灭基团，该探针在退火时与IDH1 R132H野生型位点结合。因为FAM基团和HEX基团的所用激发波长不一样，检测系统可以很好的区分两者的荧光信号值，从而计算出检测样本IDH1 R132H突变率。[0050]SEQ NO3：5’-HEX-taagcatgacgacctatgat-MGB-3’[0051]本实施例提供的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132H基因变异的引物扩增片段为83bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明提供的检测探针，可以从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1 R132H基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1 R132H基因变异进行绝对定量检测，以及用于脑胶质瘤指导临床治疗、改善患者预后。[0052]实施例2：全血样本中IDH1 R132H基因变异检测[0053]1.准备待测样品：含有野生型人IDH1 R132H基因的DNA、人IDH1 R132H突变基因的DNA、以及野生型突变DNA混合样本(其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/10000)。DNA来源于人外周血中，其中，人IDH1R132H突变基因的DNA模板来源于IDH1 R132H基因变异细胞系(经PCR测序鉴定)。[0054]2.cfDNA的提取：采用试剂盒提取cfDNA，参考QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nuleacid Kit试剂盒说明书抽提cfDNA。[0055]3.配置PCR预混液[0056]20μL的PCR预混液包括：2×数字PCR预混液(Biorad，#1863010)10μL，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的上游引物500nM，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生基因的下游引物500nM，IDH1 R132H突变基因检测探针250nM，野生型基因检测探针250nM，待测样品的cfDNA模板1ng/μL，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配制成数字PCR混合液。但需要说明的是，在其他的实施例中，各引物的浓度可以是400、450、550、600、700nM中的任意一种，只要在400-700nM的范围内即可；各探针的浓度可以是200、300、350、400nM中的任意一种，只要在200-400nM的范围内即可；待测样品的cfDNA模板浓度可以是0.3、0.5、1.5、2ng/μL中的任意一种，只要在0.3-2ng/μL的范围内即可。[0057]4.将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器，用于制备PCR微反应微滴。[0058]5.将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。

[0059]6.将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

[0060]7.PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪(QX200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，检测FAM和HEX的荧光信号。用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析结果如图1、图2、图3和图4所示。同时进行定量分析，得出样本中IDH1 R132H突

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变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。[0061]例如，待测样本中含有X个突变型基因目标分子，Y个野生型基因目标分子。经过反应及检测后，结果采用这样的方式进行分析。

[0062]

则突变型基因检测数目为X＝B，野生型基因检测数目为Y＝C，其突变频率为X/(X+Y)＝B/(B+C)。

[00]根据上述的方法对不同突变型与野生型的含量进行样品检测，突变阳性信号(FAM)与总信号数(FAM和HEX)如下：[0065]1/100样品：计算值突变/野生＝1/100，误差为零；[0066]1/1000样品：计算值突变/野生＝1/1000，误差为零；[0067]1/10000样品：计算值突变/野生＝0.999/10000，误差0.1％。[0068]由此可知，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/1000时，定量检测误差为零，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/10000时，定量检测误差为0.1％，因此可以从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

[0069]基于上述的检测方法，本实施例中的引物、探针可用于制备试剂盒，该试剂盒用于绝对定量人全血样本中IDH1 R132H基因变异。试剂盒20μL反应体系包括以下组分：[0070]其中2×ddPCR Super Mix 10.0μL，扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生型基因的上下游引物各1.0μL、IDH1R132H突变基因和野生型基因检测探针各1.0μL，cfDNA模板4.0μL，其中扩增IDH1 R132H突变基因和扩增野生型基因的上下游引物各500nM，IDH1R132H突变基因和野生型基因检测探针各250nM，cfDNA模板1ng/μL。

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序列表<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司<120> ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法<160> 4<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 23<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1ccaacatgac ttacttgatc ccc 23<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2aatatccccc ggcttgtgag 20<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3taagcatgat gacctatgat 20<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4taagcatgac gacctatgat 20

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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